2002 год

Важнейшие результаты 2002 год

1. ИЛЛЮСТРАТИВНОЕ КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ ВАЖНЕЙШИХ РЕЗУЛЬТАТОВ ЗАВЕРШЕННЫХ ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

С целью изучения влияния интеграции инсерций экзогенной ДНК на проявления собственных генов у трансгенных растений создана коллекция трансформантов табака (Nicotiana tabacum L.), характеризующихся мутантным фенотипом, затрагивающим изменение строения цветка. Анализ цитологического фенотипа мутации проведен на модельной линии Res79. Для растений этой линии было характерно увеличение размеров венчика, разрастание рыльца пестика и преобразование одной из тычинок в дополнительный лепесток (рис. 1). Низкий уровень мужской фертильности у анализируемых растений подтвержден на срезах пыльников при криосканировании в электронном микроскопе (JSM-6300F) (рис. 2). Установлено, что проявление мутации, приводящей к снижению мужской фертильности у трансгенных растений табака линии RES79, связано с перфорацией клеточной мембраны мейоцитов (рис. 3, справа) и нарушениями распределения каллозы в области перфораций (рис. 3, слева). В мейоцитах с перфорацией клеточной стенки происходила фрагментация ядер. Наблюдалось перемещение фрагментов хроматина из одного мейоцита в другой (рис. 3), что приводило к гибели их большей части. Мейоциты, вступившие в мейоз, характеризовались различными нарушениями в делениях и формировали нежизнеспособную пыльцу. Трансгенные растения созданной нами коллекции представляет большой интерес для дальнейших работ по выделению полноразмерной копии гена, мутация которого связана с нарушениями формирования клеточной мембраны в мейоцитах.

На основе работе полного секвенирования индивидуальных мтДНК проведен филогенетический анализ коммандорских алеутов и сирениковских эскимосов. Алеуты — аборигены Алеутского островного архипелага (рис. 4), включающего в себя о-в Беринга и о-в Медный (Командорские о-ва). Алеуты связаны культурной переемственностью и генетической непрерывностью с населением древней Берингии с конца ледникового периода. Филогения мтДНК иллюстрирует их происхождение от одного, корневого гаплотипа, дающего начало мтДНК-филетической линии D2 (рис. 5). До сих пор D2 не найдена вне территории древней Берингии. Впервые в кодирующем районе мтДНК алеутов обнаружена трансверсия С8910А, отличающая их от всех других популяций. Особенности географического распределения мтДНК вариантов в районе древней Берингии указывают в пользу гипотезы общности происхождения чукчей, эскимосов, алеутов и индейцев надене около 15 тыс. лет назад, но не в пользу традиционной гипотезы, по которой эскимосы и алеуты ведут свое начало от волны мигрантов из района Нижнего Амура и Хоккайдо в голоцене (~ 8 тыс. лет назад).

На основе оригинальной технологии впервые построена 8-локусная сегрегационная модель генной сети, контролирующей у самцов мышей характер наследования 3 ключевых интегративных признаков гормональной функции половой системы: гонадотропной активности (ГА), координированной реактивности клеток Лейдига (КРКЛ) и андрогенного статуса (АС). Реконструированная генная сеть состояла из 4 аутосомных локусов с диаллельной экспрессий и 4 локусов с моноаллельной экспрессий, 3 из 8 локусов характеризовались плейотропными эффектами на интегративные признаки (рис. 6). Модель генной сети включала 7 дигенных эпистатических взаимодействий и 26 различных генетических эффектов. В целом она описывала 80% наследственной изменчивости 14 исходных признаков гормональной функции половой системы. Обнаруженная генетическая изменчивость и разработанная сегрегационная модель ее наследования являются эффективным инструментом молекулярно-генетического анализа гормональной функции этой системы.

Рис. 4. Карта Алеутского архипелага с локализацией Алеутских и Командорских островов. Популяция командорских алеутов (с. Никольское на о-ве Беринга) ведет свое начало от нескольких алеутских семей, привезенных Российско-Американской кампанией в 1824-1826 гг. с нескольких алеутских островов. В настоящее время общая численность остатков командорских алеутов достигает 300-400 человек. Подавляющее большинство алеутов прослеживает свою алеутскую принадлежность только по материнской линии.

Рис. 5. Филогенетическая реконструкция мтДНК вариантов алеутов (светло-зеленые круги) и эскимосов (светло-голубые квадраты). Площадь каждой фигуры пропорциональна числу индивидуальных мтДНК данного типа (нуклеотидная последовательность) у алеутов. Жирным квадратом обозначен корневой гаплотип для филетической линии D2 (VIII вариант нуклеотидной последовательности), характерной для эскимосов, алеутов и индейцев надене.

Рис. 6. 8-локусная сегрегационная модель генной сети, детерминирующей наследование гормональной активности половой системы у самцов 6-ти инбредных линий мышей в диаллельных скрещиваниях.

На схеме локусы генной сети обозначены различными геометрическими фигурами и маркированы цифрами, а также буквами (X и Y), которые указывают на локусы с соответственно материнской или отцовской моноаллельной экспрессией, остальные локусы имеют диаллельную экспрессию. Стрелки показывают эпистатические взаимодействия между локусами. Овальными линиями различной формы ограничены группы локусов, контролирующие наследование трех ключевых интегративных признаков гормональной активности половой системы. На трех диаграммах демонстрируется соответствие, а также коэффициенты корреляции между наблюдаемыми и предсказанными значениями интегративных признаков у 36 кроссов диаллельных скрещиваний.

Разработан новый метод для поиска белков, принимающих заданную пространственную форму. Подход может использоваться для создания сложных конструкций, в т.ч. не встречающихся в живой природе. Метод применен для выявления закономерностей образования узлов в глобулярных белках (рис. 7). Пока недавно не обнаружили в базах данных заузленные белки, долгое время считалось, что природные белки не способны образовывать узлов из-за большого энтропийного барьера, осложненного стабильностью промежуточных состояний. Для решеточной модели были впервые рассчитаны белки, способные к спонтанному заузливанию. С помощью мутационного и кинетического анализа было найдено ядро нуклеации нативной структуры. Результаты спроецированы на структуры природных узельных белков.

Рис. 7. Узельный белок и его решетчатоя модель.

Фрагмент белка изомероредуктаза шпината ( Spinacia oleracea), известный своим выраженным узлом (слева), и решеточная модель узельного белка (справа).

Установлено, что биологическое здоровье и генофонд коренного населения Пуровского и Красноселькупского районов Ямало-Ненецкого автономного округа находится под прессом техногенных воздействий, что представляет особую угрозу будущим поколениям. Об этом свидетельствуют цитогенетические исследования, показавшие статистически достоверное превышение как общего уровня хромосомных аберраций (ХА), так и специфических маркеров радиационного воздействия (колец и дицентриков). Обнаружение 137Cs в биопробах (плаценте, моче, грудном молоке) свидетельствует о том, что формирующийся плод уже на ранних стадиях онтогенеза находится под воздействием ионизирующего излучения (рис. 8).

Рис. 8. Влияние техногенной нагрузки на биологическое здоровье и генофонд коренных жителей Ямало-Ненецкого автономного округа. Показано статистически достоверное превышение как общего уровня хромосомных аберраций (ХА), так и маркеров радиационного воздействия (колец и дицентриков) в популяции тундровых ненцев по сравнению с популяциями юга Сибири — русскими г. Новосибирска и жителями пос. Тюменцево, чистый р-он Алтая (Шевченко и др., 1995). Прослеживается корреляция этих показателей с содержанием радионуклида 137-Cs в биопробах (плацентах).

В рамках исследований по влиянию аллельных замещений в генах гистона Н1 на фенотип растений проведено сравнение количественных признаков трех изогенных линий посевного гороха, различающихся аллельными вариантами наиболее подвижной фракции гистона (Н1-7), которая присутствует только в молодых, активно растущих тканях. Изогенные линии, полученные бэккроссированием, показали значимые различия по ряду признаков, связанных с размером растения, количеством и средней массой семян. Наиболее интересна корреляция темпов роста растения и увеличения длины С-терминального домена молекулы фракции 7 (рис. 9). Полученные результаты свидетельствуют о функциональной связи структуры молекулы фракции гистона Н1, специфичной для растущих тканей, с темпами их роста.

Рис. 9. Темпы роста изогенных линий гороха, несущих аллельные варианты 1, 2 и 3 фракции 7 гистона Н1, специфичной для растущих тканей. Аллельные варианты пронумерованы в порядке уменьшения длины молекулы и, соответственно, увеличения ее электрофоретической подвижности. Растения посажены 9.02.2001.

Впервые установлен популяционный полиморфизм по делеции ( 425 п.н.) 11-го интрона протоонкогена c-fms, кодирующего белок рецептора фактора роста макрофагов (CSF-1R), в некоторых европеоидных и монголоидных этнических группах России. Обнаружена тенденция увеличения частот редкого аллеля по направлению с запада на восток (российские немцы — 9.45%, русские — 12.89%, казахи — 14.93% и алтайцы — 20.75%). Контекстным анализом структуры ДНК делетированного фрагмента и фланкирующих его областей было показано, наличие в этом участке гена ряда мотивов транскрипционных факторов (Ets, SRF, Myc), потенциально способных регулировать лиганд-зависимую транскрипцию гена fms (рис. 10). О функциональной значимости делетированного в одном из аллелей фрагмента ДНК свидетельствуют обнаруженные ассоциации с редким аллелем для ряда патологий — трихомониаз и острый бронхит.

Рис. 10. Контекстный анализ структуры ДНК делетированного фрагмента в 11-ом интроне гена c-fms человека, кодирующего белок рецептора фактора роста макрофагов (CSF-1R). Примечание: мелким шрифтом дана нуклеотидная последовательность делетированного фрагмента 11-го интрона. Прямоугольниками обведены мотивы транскрипционных факторов. Точками подчеркнута микросателлитная ДНК в составе палиндрома. Затенена ДНК из несовершенных tggg и tgga повторов.

Выполнен цикл исследований, демонстрирующий возможности хромосомно-инженерных подходов для создания перспективного исходного материала для селекции мягкой пшеницы. В результате изучения структуры урожая у ранее полученных иммунных аналогов сорта Саратовская 29 установлено, что качество зерна при интрогрессии материала от синтетической пшеницы T. timopheevii/T. tauschii в сорт Саратовская 29 не только не оказывает отрицательного влияния на показатели хозяйственно ценных признаков, но может и улучшать их. Таким образом, выделены перспективные линии с комплексной устойчивостью к грибным болезням и свойствами зерна, характерными для сильных и ценных пшениц (Линии III, V, VII) (табл. 1).

Таблица 1

Показатели качества зерна иммунных аналогов сорта Саратовская 29

На основе коллекции микросателлитных маркеров впервые проведено картирование гена чувствительности на яровизацию Vrn B1 на 5В хромосоме мягкой пшеницы. Показано, что наиболее вероятное расположение данного гена в области локализации микросателлитного маркера Xgwm408 (рис. 11). Полученные результаты позволяют рассматривать микросателлитные маркеры, расположенные на 5В хромосоме, как эффективный инструмент современной селекции для создания новых форм пшеницы с яровым образом жизни.

Рис. 11. Локализация признака Vrn B1 на 5В хромосоме методом интервального анализа.

Номера микросателлитных маркеров указаны на оси ординат справа. На оси абсцисс приведены значения критерия сцепления (LOD).

Создан экспериментальный комплекс для биофизических исследований, позволяющий изучать влияние гормонов и других регуляторных факторов на динамику объема клеток почечного эпителия в условиях осмотического шока. На его основе исследована водная проницаемость (Pf) базолатеральной мембраны клеток собирательной трубки наружного мозгового вещества почки крыс (ОМСD). Установлено, что в период виннинга происходит снижение нестимулированной осмотической проницаемости базолатеральной поверхности ОМСD. Увеличение Pf базолатеральной мембраны под влиянием агониста вазопрессина — десмопрессина, зарегистрировано только с 22-дневного возраста (рис. 12). Таким образом, полученные результаты свидетельствуют, что механизм регуляции вазопрессином водной проницаемости базолатеральной мембраны может отличаться от известного в настоящее время так называемого челночного механизма регуляции экспрессии водных каналов в апикальной мембране.

Рис. 12. Эффект десмопрессина (dDAVP) на водную проницаемость базолатеральной мембраны OMCD в постнатальном онтогенезе у крыс. По оси ординат — величина Pf (мкм/сек.), по оси абсцисс — возраст животных. ** — p < 0,0001 по сравнению с контролем.

Для выявления наследственной предрасположенности к проявлению артериальной гипертензии под влиянием неблагоприятных условий социальной среды в критические сроки развития исследовали влияние хронической социальной изоляции и социальной нестабильности, обусловленной постоянной ротацией партнеров в клетке, в ювенильном периоде (в течение 4 недель, начиная с 21 дня жизни) на артериальное давление взрослых особей. Оба воздействия привели к повышению артериального давления у генетически нормотензивных крыс Вистар как в состоянии покоя, так и при остром стрессе, вызванном ограничением подвижности (рис. 13). У крыс с наследственной стресс-чувствительной артериальной гипертензией (НИСАГ) социальная изоляция не вызвала длительных изменений артериального давления, тогда как стресс, обусловленный социальной нестабильностью, оказал стойкий антигипертензивный эффект.

Рис. 13. Систолическое артериальное давление (M m) в состоянии покоя (базальное) и при остром стрессе (ограничение подвижности), у взрослых крыс линий Вистар и НИСАГ, подвергавшихся в ювенильном периоде воздействию социальной изоляции или социальной нестабильности.

*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001 по сравнению с контрольными крысами (по результатам post hoc сравнений).

Показано участие тиреоидных гормонов в регуляции плотности и экспрессии 5-HT2A рецепторов коры мозга у крыс. Плотность 5-HT2A рецепторов, оцененная по интенсивности рецепторного связывания меченого специфического антагониста рецепторов, [3H] кетансерина, была снижена у тиреоидэктомированных животных (рис. 14). Хроническое введение физиологической дозы тироксина предотвращало снижение плотности 5-HT2A у тиреоидэктомированных животных. С помощью метода ОТ-ПЦР было установлено, что снижение плотности 5-HT2A рецепторов вызвано уменьшением уровня кодирующей их мРНК (рис. 14). Исследование имеет значение для выяснения роли тиреоидных гормонов и 5-HT2A рецепторов в молекулярном механизме депрессии.

Рис. 14. Влияние тиреоидэктомии на плотность и уровень мРНК 5-HT2A рецепторов в коре крыс.

ЛО — ложно оперированные, ТЭ — тиреоидэктомированные.
*p<0.05, ***p<0.001 по сравнению с ложно оперированными.