2005 год

Важнейшие результаты 2005 год

Иллюстративное краткое изложение важнейших результатов за-вершенных фундаментальных исследований Института цитологии и генетики СО РАН в 2005 году

При помощи метода microarray выявлено около 1000 генов, которые недореплицированы в политенных хромосомах дрозофилы. Эти гены собраны примерно в 52 кластера, содержащих от 10 до 40 генов (рис. 1). Размеры зон недорепликации составляют от 110 до 620 т.п.н. Все выявленные этим методом кластеры локализованы в районах поздней репликации. Сравнение локализации кластеров этих генов с сайтами поздней репликации в хромосомах КС клеток показало их совпадение в 96% случаев, то есть разные типы клеток имеют сходный характер регуляции репликации генов в интеркалярном гетерохроматине. Гены в пределах кластеров не только координированно реплицируются, но проявляют также координированную экспрессию, так как в этих кластерах находятся наборы генов, которые транскрибируются в одно и то же время. Таким образом, интеркалярный гетерохроматин представляет собой большой класс хроматиновых доменов, состоящих из координированно регулирующихся и экспрессирующихся генов. В политенных хромосомах слюнных желёз эти гены инактивированы, что приводит к формированию гетерохроматиновой структуры районов интеркалярного гетерохроматина. (Приоритетные направления РАН — 5.4.; Программа СО РАН 20.1.)

Рис. 1. Протяженность и число генов в генных кластерах из районов недо-репликации в политенных хромосомах дрозофилы.
a. Различия в длине районов недорепликпации
b. Различия в числе генов в недореплицированных доменах
По оси ординат: число районов. По оси абсцисс: (a) длина районов недорепликации, (b) число генов в недореплицированных доменах

На основе иерархического подхода создана технология математического моделирования генетически регулируемого метаболизма бактериальной клетки. Разработана база моделей элементарных процессов E.coli: 372 ферментативных реакций и 27 промоторов E.coli (рис. 2). Разработан прототип компьютерной системы для моде-лирования генетических процессов регуляции метаболических процессов. Доказан ряд мате-матических теорем, имеющих важное значение для развития теории генных сетей и редук-ции моделей. Проведен численный и теоретический анализ моделей ряда гипотетических генных сетей, и разработана принципиальная конструкция теоретико-экспериментальной ге-нетической системы, предназначенной для проведения массовых экспериментов по изуче-нию механизмов функционирования промоторов прокариот. (Приоритетные направ-ления РАН — 5.30.; Программа СО РАН 23.1.)

Рис. 2. Построение интегрированной модели генетически регулируемого метаболизма клетки прокариот.

Создана коллекция трансгенных растений табака с мутантным фенотипом (нарушения структуры цветка и снижение уровня мужской фертильности). Установлено, что снижение уровня мужской фертильности обусловлено сложной картиной цитологических нарушений микротрубочкового цитоскелета материнских клеток пыльцы (МКП): блокирова-ние полимеризации фибрилл микротрубочек и нарушение их соединения в области экватора в поздней телофазе 1 (Рис. 3, а); частичное блокирование размыкания и деполимеризации интерзональной системы микротрубочек (Рис. 3, б). Выявленные аномалии вызывали нару-шение взаимной ориентации дочерних ядер в профазе 2 мейоза, что приводило к неправиль-ной ориентации веретен второго деления и формированию общих структур цитоскелета (Рис. 3, в и г). Полученные результаты объясняют картину нарушений мутантного фенотипа у ге-нетически модифицированных растений. (Приоритетные направления РАН — 5.3.; Программа СО РАН 19.2.)

Рис. 3. Динамика микротрубочкового цитоскелета в МКП мутантных рас-тений (верхний ряд) и в МКП контрольных растений (нижний ряд).

а — нарушение полимеризации и соединения интерзональных микротрубочковых фибрилл в зоне экватора в поздней телофазе 1 — интеркинезе;
б — нарушение деполимеризации интерзональной системы микротрубочек в профазе 2;
в — формирование общего перинуклеарного кольца в ранней прометафазе 2 у мутантных рас-тений;
г — объединенные хаотические фигуры цитоскелета в общей цитоплазме в средней промета-фазе 2 у мутантных растений;

Разработан новый способ репрограммирования генома диффренци-рованных клеток, основанный на использовании потенциала эмбриональных стволовых (ЭС) клеток при их слиянии со специализированными клетками взрослого организма. Впервые показано, что плюрипотентность, привнесенная геномом ЭС клеток, доминирует в гибрид-ных клетках и не зависит от количества хромосом дифференцированного партнера. Плюри-потентность оценивалась комплексом методов, включавшим использование молекулярных маркеров, иммунофлюоресцентный анализ тератом и способность генерировать химер. На рис. 4 показаны два химерных животных, полученных путем инъекций гибридных клеток клона НМС15, содержащих только 2 хромосомы спленоцита на фоне хромосом ЭС клеток (А), и околодиплоидных клеток клона НМС29, содержащего 13 пар гомологичных хромосом ЭС клеток и спленоцитов (Б). Видно, что уровень химеризма высок у обоих животных (жел-тые пятна на фоне черной окраски), что свидетельствует о заметном вкладе гибридных кле-ток в формирование химер. Предполагается, что этот феномен доминирования лежит в осно-ве репрограммирования генома дифференцированных клеток в гибридных клетках типа ЭС-фибробласт или спленоцит. (Приоритетные направления РАН — 5.7., 5.8.; Программа СО РАН 20.3.)

Рис. 4. Два химерных животных, полученных инъекцией гибридных кле-ток НМС15 (А) и НМС29 (Б). Хорошо видны пятна желтого цвета на фоне черной окраски. Пятна желтого цвета развиваются только из гибридных клеток, введенных в бластоцисту мышей с черной окраской.

Впервые описана локализация нормального гена c-kit на B-хромосомах млекопитающих: у красной лисицы ( Vulpes vulpes) и двух подвидов ено-товидной собаки ( Nyctereutes procyonoides) (рис. 5). Ранее общепринятой считалась точка зрения, что B-хромосомы не несут структурных генов и представляют собой паразити-ческие и/или эгоистичные элементы генома. Идентификация полноразмерного c-kit протоон-когена на B-хромосомах двух видов Canidae, которые отделились от общего предка более чем 12.5 миллионов лет назад, свидетельствует против общепринятого представления о происхождении добавочных хромосомах и их потенциальной роли в геноме. (Приоритетные направления РАН — 5.3., 5.25.; Программа СО РАН 20.1.)

Рис. 5. Локализация полноразмерного гена рецептора тирозин кина-зы(протоонкоген C-kit) на аутосомах (показаны цифрами) и добавочных хромосомах (показаны стрелками) у лисицы (А) и енотовидной собаки (Б).

Впервые построены молекулярно-генетические карты хромосом тетраплоидных пшениц группы Timopheevi (2n=28, геномная формула — GGAtAt) и проведено их сравнение с аналогичными картами второй эволюционной линии пшениц группы Emmer (2n=28, геномная формула — BBAA). Показано, что порядок расположения маркеров в большинстве случаев сохраняется между гомеологическими группами хромосом A и At, B и G геномов (рис. 6). В то же время выявлен ряд нарушений порядка маркеров для отдельных участков 6At, 1G и 2G хромосом, что является следствием как дивергенции доноров диплоидных геномов еще до образования тетраплоидных форм, так и реконструкции геномов в процессе образования и эволюции тетраплоидов. (Приори-тетные направления РАН — 5.3.; Программа СО РАН 20.1.)

Рис. 6. Молекулярно-генетическая карта хромосомы 5At, построенная с использованием F2 популяций I ( T. timopheevii var. timopheevii ? T. timopheevii var. typica) и II ( T. timopheevii К38555 ? T. militinae) в сравнении с картой хромосомы 5А T. aestivum (ITMI популяции). Область транслокации между 5А и 4А хромосо-мами (TBP 5AL-4AL) указана пунктиром.

Исследовано распределение трех экзонных мутаций (C282Y, H63D и S65C) гена гемохроматоза HFE, связанного с заболеваниями метаболизма железа, и трех его интронных полиморфизмов: IVS2 (-4; t/c), IVS4 (-44; t/c) и IVS5 (-47; a/g) в 5 этнических группах Сибири (рис. 7). Мутация C282Y встречается только у русских с частотой 3,7% при частоте интронного гаплотипа TTG — 44%. Соотношение вариантов СТА с мутацией H63D и без неё этноспецифично. Мутация S65C обнаружена только у русских и чукчей. Интронный гаплотип ССА у русских составляет 7,3%, треть их сцеплены с S65C. У чукчей частота гап-лотипа ССА равна 38,4%, а доля их, сцепленная с S65C, близка к таковой у русских — 1,7%. Таким образом, впервые показано этноспецифическое распределение как экзонных, так и ин-тронных полиморфизмов гена HFE. (Приоритетные направления РАН — 5.3.; Про-грамма СО РАН 20.1.)

Рис. 7. Этноспецифическое распределение интронных полиморфизмов ге-на гемохроматоза HFE.
Обнаружено четыре интронных гаплотипа — TTA, TTG, CTA и CCA. Экзонная мутация C282Y сцеплена с вариантом TTG, H63D с CTA, а S65C с ССА.

Разработан универсальный метод составления генетических карт млекопитающих основанный на одновременной визуализации индивидуальных дифферен-циально окрашенных мейотических хромосом, сайт-специфичных ДНК-проб и антител к белкам центромер (CENPA) и рекомбинационного комплекса (MLH1, RAD51). Подсчет час-тоты сайтов связывания рекомбинационных белков, локализованных между сайтами гибри-дизации клонов ДНК отдельных генов дает оценку частоту рекомбинации между этими ге-нами и позволяет составлять генетические карты любых видов млекопитающих без поста-новки скрещиваний. Апробация этого метода проведена на сперматоцитах обыкновенной бурозубки (Рис. 8). (Приоритетные направления РАН — 5.19., 5.21.; Программа СО РАН 20.2.)

Рис. 8. Микрофотография мейотической клетки обыкновенной бурозубки. Треугольниками указано положение центромер, Стрелками — положение рекомбинационных комплексов. Буквами m и n обозначены районы гибридизации с клоном ДНК, выделенной из специфических районов хромосом.

Путем анализа генетического сцепления микросателлитных ДНК-маркеров, распределенных по длине 1-ой хромосомы крысы, с величинами артериального давления в покое и при стрессе идентифицированы генетические локусы (обозначены чер-ными стрелками), ответственные за повышение артериального давления у крыс линии НИСАГ с наследственной артериальной гипертонией (рис. 9). Эти локусы соответствуют следующим генам: Chrna7 — рецепторы ацетилхолина, Th — тирозингид-роксилаза (ключевой фермент биосинтеза адреналина) и Vldlr — рецепторы липо-протеинов очень низкой плотности. (Приоритетные направления РАН — 5.3.; Про-грамма СО РАН 21.1.)

Рис. 9. Поиск генов ответственных за повышение артериального давления у крыс линии НИСАГ с наследственной стресс-чувствительной артериальной гипертонией
Изображенные на рисунке кривые соответствуют изменению показателей сцеп-ления (LOD score) лежащих под кривыми соответствующих районов первой хромосомы с величинами артериального давления при стрессе (нижняя кривая) артериального давления в покое (средняя кривая) и при суммарной оценке обоих показателей артериального давления (верхняя кривая).

Cоздана инбредная линия мышей ASC (14 поколений инбридинга) с измененной серотониновой системой мозга (рис. 10). Животные этой линии характеризуются аномально высокими (~90% особей) для лабораторных мышей (обычно 0-20% особей) про-явлениями реакции замирания и депрессивно-подобного поведения. Линия ASC предложена для изучения молекулярных механизмов депрессивных расстройств и действия антидепрес-сантов. (Приоритетные направления РАН — 5.3., 5.7.; Программа СО РАН 20.3.)

Рис. 10. Влияние хронического введения антидепрессантов на выражен-ность реакции замирания у мышей линии ASC. Черные сектора — доля мышей, проявляющих реакцию замирания.

Известно, что гепатоканцероген — 3′-метил-4-диметиламиноазобензол (3′-МеДАБ) вызывает опухоли печени у крыс, но не у мышей, а ор-то-аминоазотолуол (ОАТ) у мышей, но не у крыс. Выявлен видоспецифический сенсор этих гепатоканцерогенов — конститутивный андростановый рецептор (CAR), который в отличие от остальных исследованных нами рецепторов ксенобиотиков (LXR, PPAR, PXR и Ah-R) акти-вируется видоспецифическим образом, т.е. у мышей сильнее в ответ на введение животным ОАТ, чем на введение 3′-МеДАБ, а у крыс, наоборот, сильнее в ответ на введение 3′-МеДАБ (Рис 11). Кроме того, в экспериментах по конкуренции гепатоканцерогенов с природным ли-гандом CAR андростенолом было показано, что и ОАТ и 3′-МеДАБ способны выступать в качестве лигандов CAR, причем ОАТ лучше связывается с CAR мыши, а 3′-МеДАБ — крысы. (Приоритетные направления РАН — 5.4.; Программа СО РАН 19.1.)

Рис. 11. Результаты экспериментов по задержке меченой олигонуклеотид-ной пробы в геле, демонстрирующие видоспецифическую активацию конститутивного ре-цептора андростанов (CAR) в печени мышей под действием гепатоканцерогенного для них ОАТ и в печени крыс под действием гепатоканцерогенного для них 3′-МеДАБ.

Впервые обнаружено, что отсутствие нейрогипофизарного гормона вазо-прессина принципиально меняет динамику роста опухоли у крыс (рис. 12). У крыс линии WAG с нормальным фоном вазопрессина введение клеток линейнонеспецифической кар-циносаркомы Walker 256 сопровождается формированием солидной опухоли с последую-щим летальным исходом. У крыс Brattleboro с наследственным дефектом синтеза ва-зопрессина наблюдается возникновение небольших опухолевых узлов, быстро переходящих в стадию регрессии до полного исчезновения опухоли. У потомков ( WAG x Brattle-boro) F1, несущих один нормальный аллель гена вазопрессина и способных синтезиро-вать этот гормон, наблюдалась одинаковая с родительской линией WAG динамика роста опухоли и гибель животных. (Приоритетные направления РАН — 5.13.; Программа СО РАН 20.3.)

Рис. 12. Динамика развития карциносаркомы Walker 256. А — у физиоло-гически нормальных крыс линии WAG и крыс линии Brattleboro с наследственным дефектом синтеза вазопрессина; В — у родительской линии WAG и гибридов ( WAG x Brattleboro) F1. Достоверность различий между экспериментальными группами: * — р < 0,001.