2013 год

1. Проект «Изучение микробных сообществ озер Новосибирской области и Алтайского края». Руководитель проекта – к.б.н. С.Е. Пельтек.
2. Проект «Поиск и сбор растительного материала для выявления альтернативных источников целлюлозы». Руководитель проекта – к.б.н. Н.В. Бурмакина.
3. Проект «Формирование банка ДНК алтайского марала (Cervus elaphus sibiricus) для молекулярно-генетического анализа его генофонда».
   Руководитель проекта – д.б.н. Н.С. Юдин.
4. Проект «Гинодиэция  у Fragaria vesca L. как проявление эпигенетического контроля половой структуры популяции». Руководитель проекта – к.б.н. С.О. Батурин.
5. Проект «Динамика биоразнообразия диких ди-и тетраплоидных видов пшениц и их сородичей на Армянском Нагорье». Руководитель проекта – чл.-корр. РАСХН
   Н.П. Гончаров.
6. Проект «Изучение антропогенной сукцессии в экосистеме малой реки Кинтереп после дражной добычи золота». Руководитель – А.И. Стекленева.
7. Проект «Изучение молекулярных механизмов и распространенности наследственной глухоты в популяциях Сибири» (лаб. рекомбинационного и сегрегационного анализа, руководитель к.б.н. О.Л. Посух.
8.  Проект «Поиск генетических следов Денисовского человека в современных популяциях, проживающих на территории юга Западной Сибири». Руководитель проекта – к.б.н. М.А. Губина.
9. Проект «Динамика изменений генофонда популяции тундровых ненцев Ямало-Ненецкого АО в условиях урбанизации». Руководитель – к.б.н. Л.П. Осипова

Международные проекты и соглашения с зарубежными партнерами

1.Изучение механизмов инактивации Х-хромосомы и картированию генов Monodelphis domestica

Юго-западный главный региональный исследовательский центр Сан-Антонио США. ИЦиГ СО РАН, зав. лаб. д.б.н. С.М. Закиян.

2.Российско-германская виртуальная сеть по биоинформатике «Компьютерная системная биология

Разработка алгоритмов для биоинформационного анализа комплексных метаболических и молекулярно-генетических сетей», г.к. № 02.740.11.0882. С немецкой стороны проект поддержан BMBF. Руководитель:  директор ИЦиГ СО РАН, академик Н.А. Колчанов.

3.Изучение генетической основы изменений у крыс при отборе на агрессивное и ручное поведение

Институт Макса Планка эволюционной антропологии, Лейпциг, Германия, профессор Сванто Паабе. ИЦиГ СО РАН, зав. лаб. эволюционной генетики  д.б.н. А.Л. Маркель.

4.Палеогенетическое исследование древнего населения Сибири

Институт Макса Планка эволюционной антропологии, Лейпциг, Германия, профессор Сванто Паабе. ИЦиГ СО РАН, межинститутский сектор молекулярной палеогенетики, к.б.н.
А.С. Пилипенко.

5.Исследование структурно-функциональной организации фоторецепторных клеток в сетчатке животных с ночным видением

Отделение биологии II, Мюнхенский университет им. Людвига-Максимилиана, Мюнхен, Германия, д-р И. Соловей, д-р В. Йоффе. ИЦиГ СО РАН, лаб. морфологии и функции клеточных структур, к.б.н. Е.В. Киселева.

6.Оценка зародышевой плазмы пшеницы на морозоустойчивость методами полногеномного анализа и методом оценки генов-кандидатов

Селекционная компания Deutsche Saatveredelung AG, г. Липпштадт. д-р Дитер Стеллинг. ИЦиГ СО РАН, зав. сектором генетики качества зерна  к.б.н. Т.И. Пшеничникова.

7.Цитогенетический анализ клеточного деления в зародышевой линии дрозофилы

Лаборатория генетики отделения биологии Университета Турку, Финляндия, д-р С. Ноккала.  ИЦиГ СО РАН,  сектор генетики клеточного цикла, зав. сектором к.б.н. С.А. Федорова.

8.Разработка и применение методов полногеномного анализа высокоразмерных признаков с помощью смешанных моделей.

Европейский Институт по биологии старения (Eriba), Гронинген, Нидерланды, профессор Е. Березиков. ИЦиГ СО РАН, лаборатория рекомбинационного и сегрегационного анализа, д.б.н.
Ю.С. Аульченко.

9.Экспериментальная генетическая интрогрессия межу видами рода Pisum (горох)

Agritec Plant Research Ltd., Чешская Республика, Петр Смыкал. ИЦиГ СО РАН, лаб. генетики и эволюции бобовых растений, зав. лаб. к.б.н. О.Э. Костерин

<p >10.Сортировка хромосомы 5В мягкой пшеницы сорта Чайниз Спринг методом проточной цитометрии и построение ВАС библиотеки<p >Институт экспериментальной ботаники Академии наук Чешской республики, Прага, ЧР. ИЦиГ СО РАН, лаб. молекулярной генетики и цитогенетики растений, зав. лаб. д.б.н. Е.А. Салина

11.Построение физической карты короткого плеча хромосомы 5В методами биоинформатики

Израильская биоинформатическая компания MultiQTL Ltd,  Institute of Evolution, University of Haifa. ИЦиГ СО РАН, лаб. молекулярной генетики и цитогенетики растений, зав. лаб. д.б.н.
Е.А. Салина

12.Исследование паразитарных систем описторхид на смежных территориях России и Казахстана (бассейн реки Иртыш, внутренние бассейны Северного Казахстана)

КАУ (Казахский агротехнический университет), г. Астана. Зав. центром биотехнологий к.б.н. С.Н. Боровиков. ИЦиГ СО РАН, лаб. молекулярных механизмов патологических процессов, зав. лаб. д.б.н. В.А. Мордвинов.

13.Проведение совместных исследований по созданию перспективных селекционных линий мягкой пшеницы, устойчивых к абиотическим и биотическим факторам среды, с использованием современных достижений в области молекулярной генетики, селекции и хромосомной инженерии и дальнейшему их практическому использованию

Представительство Международного центра улучшения кукурузы и пшеницы (СИММИТ) в Центральной Азии и Закавказье, Астана, Представитель СИММИТа в ЦАЗ, д.б.н., профессор, академик М.К. Карабаев.  ИЦиГ СО РАН, лаб. молекулярной генетики и цитогенетики растений, зав. лаб. д.б.н. Е.А. Салина.

14.Исследования растворимости и стабильности белковых препаратов в водных растворах, приготовленных на основе высокоочищенной воды

Кафедра биохимии Самаркандского государственного университета Республики Узбекистан.

ИЦиГ СО РАН, лаб. физиологической генетики,  д.б.н. И.И. Хегай.

Сведения

об участии Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук в реализации федеральных целевых, ведомственных и региональных программ в 2013 г.

1. Наименование программы

Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007–2013 гг.

2. Заказчик программы

Министерство образования и науки РФ

3. Наименование проектов

3.1. Проект «Поиск и маркирование новых генов, определяющих хозяйственно ценные признаки, и их использование для создания селекционно-перспективных линий растений»

г/к 14.512.11.0062 от 17.04.2013 г.

3.2. Проект «Разработка программного комплекса для анализа влияния SNP на функцию генов, связанных с развитием социально значимых заболеваний»

г/к 14.512.11.0094  от 26.06 2013 г.

3.3. Проект «Создание методов метаболической инженерии термофильных микроорганизмов для получения штаммов-продуцентов молочной кислоты»

г/к 14.512.11.0050 от 03.04.2013 г.

3.4. Проект «Разработка методов генетической модификации термофильных микроорганизмов с целью создания термоустойчивых штаммов- продуцентов, предназначенных для трансформации сахаров из возобновляемых  источников биомассы в биоэтанол»

г/к 14.512.11.0057 от 02.04.2013 г.

3.5. Проект «Разработка ферментов и биокатализаторов для процессов получения ценных пищевых жиров и биотоплива»

г/к 14.512.11.0065 от 19.04.2013 г.

3.6. Проект «Разработка биокаталитических методов превращения биомассы мискантуса в этанол»

г/к 14.512.11.0072 от 19.04.2013 г.

4. Основные результаты законченных этапов работы

4.3.1. В ходе выполнения проекта в результате обобщения данных получены следующие основные теоретические и экспериментальные результаты: впервые определена полная нуклеотидная последовательность у двух аллелей гена VRN-B1 (сорта пшеницы Саратовская 29 и Диамант 2); проведено изучение аллельных вариантов генов VRN-1 пшеницы, определяющих время созревания, и определены частоты их встречаемости по результатам анализа 85 генотипов растений. Показано, что наиболее распространенным VRN-1-гаплотипом яровой мягкой пшеницы на всей территории от Западной Европы до Западной Сибири и Казахстана является гаплотип Vrn-A1a Vrn-B1a/Vrn-B1c vrn-D1. Характерной особенностью сортов, произрастающих на территории России, Украины и Казахстана, является широкое распространение аллеля Vrn-B1с.

Проведена оценка времени колошения, устойчивости к мучнистой росе и бурой ржавчине, кустистости и высоте растений у 23 линий пшеницы, отобранных с использованием молекулярных маркеров к гену устойчивости к мучнистой росе и разработанных к новому гену устойчивости к бурой ржавчине. Выделено 11 перспективных линий, которые можно рекомендовать для передачи в селекционные центры, из них 6 линий, отобранных с использованием двух маркеров, различаются по времени созревания и обладают комплексной устойчивостью к грибным заболеваниям.

Показано, что родительские линии (21-4 и 29-2) можно использовать в качестве доноров признаков устойчивости соответственно к бурой ржавчине и мучнистой росе при создании сортов среднеспелой и среднепоздней групп спелости.

Разработана лабораторная методика генотипирования растений с использованием молекулярных маркеров.

Разработан перечень молекулярных маркеров с указанием их характеристик для идентифицированных новых генов ответа на яровизацию пшеницы, влияющих на сроки созревания.

Опубликованы две работы в рецензируемых изданиях. Подана заявка на получение патента РФ на изобретение «Способ создания яровых форм мягкой пшеницы, отличающихся по времени колошения, с комплексной устойчивостью к грибным заболеваниям».

4.3.2. Подготовлен обзор существующих математических моделей, методов и программного обеспечения для анализа влияния SNP на нарушение функций генов, связанных с появлением социально значимых заболеваний.

Разработаны и адаптированы математические модели влияния SNP на нарушение функций генов, связанных с появлением социально значимых заболеваний.

Разработан экспериментальный образец модульной компьютерной информационной системы (ЭО МКИС) для анализа влияния SNP на нарушение функций генов, связанных с появлением социально значимых заболеваний, включающий следующие программные компоненты:

– программная компонента «Геномика» для оценки эффекта влияния SNP на функционирование регуляторных районов генов;

– программная компонента «Протеомика» для оценки эффекта влияния SNP в участках генов, кодирующих белки;

– программная компонента «Генные сети» для оценки эффекта влияния SNP на генные сети;

– база данных «Информационный ресурс», включающая информацию об аннотации генома человека, функционально значимых SNP, сценариях анализа SNP и другую информацию, важную для оценки влияния SNP на функцию генов, связанных с развитием социально значимых заболеваний;

– разработана программная документация на ЭО МКИС.

Разработаны макеты сценариев анализа влияния полиморфизмов на изменение функции генов.

Разработана Программа и методики испытаний (ПМИ) ЭО МКИС и выполнены испытания ЭО МКИС в соответствии с разработанной ПМИ, показавшие работоспособность ЭО МКИС и сценариев биоинформационного анализа данных на контрольных примерах геномных SNP, ассоциированных с развитием социально значимых заболеваний.

Разработаны методические рекомендации по использованию разработанных сценариев биоинформационного анализа влияния SNP на нарушение функций генов, связанных с появлением социально значимых заболеваний. Проведена технико-экономическая оценка рыночного потенциала полученных результатов.

Разработан проект технического задания на проведение ОКР по теме: «Создание модульной компьютерной информационной системы (МКИС) для анализа влияния SNP на нарушение функций генов, связанных с появлением социально значимых заболеваний». По результатам исследования опубликованы 3 статьи в журнале из списка ВАК.

4.3.3. Цель работы: разработать методы генной и метаболической инженерии для новых объектов биотехнологии – промышленно значимых микроорганизмов – и провести оценку потенциала рекомбинантных штаммов для использования в биотехнологических процессах; получить рекомбинантные штаммы-продуценты молочной кислоты на основе бактерий Geobacillus spp.

В результате выполнения проекта проведен анализ информационных источников. Из коллекции ИЦиГ СО РАН отобраны термофильные штаммы, перспективные для получения молочной кислоты. Методами МАЛДИ масс-спектрометрии и секвенирования участка гена 16S рРНК из 25 отобранных штаммов 21 идентифицирован как микроорганизмы рода Geobacillus spp. Установлено, что среди исследованных штаммов Geobacillus spp. большинство успешно осуществляет конверсию гексоз и пентоз на минеральной среде. Разработана математическая модель оптимизации синтеза молочной кислоты штаммами Geobacillus spp. На основе моделирования определена стратегия внесения направленных изменений в геном Geobacillus. Для модификации генома выбраны штаммы Geobacillus G1w2 и 53. Открыт новый вид микроорганизмов рода Geobacillus – природный штамм G1w2 из термального источника Долины гейзеров. Разработаны и созданы генетические конструкции для модификации метаболических путей бактерий рода Geobacillus на основе математической модели и проведенного полногеномного секвенирования штамма 53.     Разработаны протоколы введения направленных изменений в геном бактерий рода Geobacillus для оптимизации продукции молочной кислоты. В соответствии с разработанными протоколами проведено конструирование двух рекомбинантных штаммов Geobacillus stearothеrmophilus 53 и Geobacillus stearothеrmophilus 53(2) – продуцентов молочной кислоты, проведен их молекулярно-генетический анализ, показано наличие направленных изменений в их геномах.

Разработаны способы культивирования, оптимизирующие скорости роста штаммов Geobacillus stearothеrmophilus 53 и Geobacillus stearothеrmophilus 53(2)  и выход  молочной кислоты. На этой основе созданы экспериментальные образцы рекомбинантных штаммов-продуцентов молочной кислоты и проведены их исследовательские испытания в условиях биореактора. Показано, что экспериментальные образцы рекомбинантных штаммов обладают большей (минимум в два раза) продуктивностью молочной кислоты по сравнению с исходным штаммом, стабильны в условиях культивирования при рН 7,5 и температуре 65 °С в течение 48 часов. Степень конверсии глюкозы в молочную кислоту составила около
90 %. Получено два экспериментальных образца молочной кислоты. Проведена технико-экономическая оценка рыночного потенциала результатов НИР и разработаны рекомендации их использования в практике.

Разработанные в проекте методы будут способствовать созданию производства химических веществ при помощи микроорганизмов. Проект направлен на повышение комплексности и глубины переработки возобновляемого непищевого растительного сырья и соответствует компетенции Технологической платформы «БиоТех2030».

Результаты, полученные при выполнении проекта, будут способствовать развитию новой сырьевой базы (возобновляемая непищевая биомасса) для химической промышленности, в частности для производства биодеградируемых пластиков на основе молочной кислоты.

4.3.4. Целью исследования является проведение проблемно ориентированных исследований, направленных на разработку способов и методов модификации генома термофильных бактерий рода Geobacillus, создание новых штаммов-продуцентов на основе направленной модификации путей их метаболизма, предназначенных для получения биоэтанола.

В ходе выполнения проекта проведен анализ информационных источников. Из коллекции ИЦиГ СО РАН отобраны термофильные штаммы, перспективные для получения биоэтанола. Методами МАЛДИ масс-спектрометрии и секвенирования участка гена 16S рРНК из 38 отобранных штаммов 22 идентифицированы как микроорганизмы рода Geobacillus spp. Для 19 штаммов Geobacillus spp. и 1 штамма Anoxybacillus sp. определены фенотипические и функциональные характеристики: термостабильность, субстратная специфичность, скорость роста на различных средах, соотношение целевого (биоэтанол) и побочных продуктов метаболизма. Исследуемые штаммы имели оптимум роста в диапазоне 55–70 °С. Штамм 22(х) отобран как исходный  штамм,  оптимальный по усредненным параметрам скоростей роста, конверсии источников углерода и другим важнейшим биотехнологическим показателям.

Разработана кинетическая модель метаболических путей бактерий рода Geobacillus, проведено секвенирование  геномов исходных штаммов. Определена стратегия внесения направленных изменений в геном Geobacillus. Разработаны дизайн олигонуклеотидов и генетические  конструкции для введения направленных  изменений  в геном Geobacillus spp. Сконструированы шатл-векторные плазмиды для введения направленных изменений в геном бактерий рода Geobacillus. Разработана методика контроля трансформации в геноме  исходных штаммов, предназначенных для получения биоэтанола.

На основе исходного штамма Geobacillus stearothermophilus 22(х), выделенного из термального источника Северного Прибайкалья, проведено конструирование и создание рекомбинантных штаммов Geobacillus stearothermophilus 22 и Geobacillus stearothermophilus 22(2), различающихся набором генетических модификаций.

Получено два экспериментальных образца новых рекомбинантных штаммов микроорганизмов, перспективных для синтеза биоэтанола. Рекомбинантные штаммы Geobacillus stearothermophilus 22 и Geobacillus stearothermophilus 22(2) депонированы во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов. Отработаны условия культивирования штаммов в биореакторе. Разработана лабораторная методика получения биоэтанола с использованием новых рекомбинантных штаммов микроорганизмов. На основе разработанных рекомбинантных штаммов микроорганизмов получено два экспериментальных образца биоэтанола. Свойства экспериментальных образцов изучены согласно Программе и методикам исследовательских испытаний экспериментальных образцов рекомбинантных штаммов микроорганизмов и целевого продукта.

При выполнении НИР создан проект технического задания на проведение прикладной НИР по теме: «Масштабирование процесса получения биоэтанола с применением термостабильных штаммов». Подведены итоги НИР и дана технико-экономическая оценка результатов НИР, а также  рекомендации и предложения по использованию результатов НИР в реальном секторе экономики.

4.3.5. Целью работы является создание научно-технического задела для разработки экологически безопасных и конкурентоспособных биокаталитических технологий получения продуктов органического синтеза; разработка ферментов липаз и биокатализаторов на их основе, характеризующихся экологической чистотой, для процессов получения ценных пищевых жиров и биотоплива.

В результате выполнения проекта в целом, с учетом разработанных экспериментальных и методических подходов, были получены 4 новых фермента липазы бактерий рода Geobacillus, их виртуальный скрининг показал, что наиболее перспективной для использования является липаза G3. На основе липаз G5 и G3 разработаны новые штаммы-продуценты термостабильных липаз бактерий рода Geobacillus на основе штаммов Esherichia coli (2 образца). Из штаммов в соответствии с разработанным лабораторным регламентом получены экспериментальные образцы липаз (всего 4 шт.) в количестве 2,2387 г. Разработаны методики определения активности липаз, рН-оптимума липаз, диапазона температурной устойчивости и активности биокатализаторов. Проведена ковалентная иммобилизации фермента липаза G3 на силикагеле, разработан лабораторный регламент получения биокатализаторов на основе липаз. В соответствии с ним получены 2 экспериментальных образца биокатализатора на основе липаз: для получения биодизеля  в количестве 3,7 г (БД-1) и для производства пищевых жиров в количестве 12,7 г. Разработаны программы и методики исследовательских испытаний экспериментальных образцов биокатализаторов и новых ферментов, в соответствии с ними проведены исследовательские испытания. Показано, что разработанные липазы обладают высокой активностью и термостабильностью (вплоть до 70 °С), имеют оптимум активности при рН 7–9. Образец липазы БР-G3-2 (липаза G3) обладает высокой операционной стабильностью, в том числе в присутствии 70 % спирта, и является перспективным для применения в составе гетерогенных биокатализаторов. В ходе испытания образцов биокатализаторов показано соответствие испытанных образцов БП-1 и БП-2 требованиям п. 6.2.3, 6.2.2 ТЗ ГК № 14.512.11.0065 от 19.04.2013 г., а также определены оптимальные условия их эксплуатации в различных режимах. Показана высокая операционная стабильность образца БП-1 при испытаниях в статическом режиме. Разработана методика исследования распределения подвижной фазы в слое биокатализатора с использованием метода магнитно-резонансной томографии. При помощи разработанной методики  показано, что распределение масла в слое биокатализатора и силикагеля имеет существенные отличия, а проведение опрессовки слоя биокатализатора является необходимым условием для обеспечения равномерной и достаточной пропитки его слоя. Проведена технико-экономическая оценка результатов НИР и выявлено, что результаты являются конкурентоспособными, а продукция востребована рынком; при организации производства суммарный объем произведенной продукции в течение 5 лет составит 260317145 руб. Разработан проект Технического задания на ОТР по теме «Разработка технологии производства биокатализатора для получения жиров специального назначения» и рекомендации по использованию результатов при масштабировании.  Новизна использованных подходов состоит в получении новых оригинальных термостабильных липаз с показателями, превышающими свойства аналогичных липаз. Получение новых непатентованных ферментов для применения в промышленности является приоритетной задачей для современной биотехнологии. Выполнено материально-техническое обеспечение работ.

4.3.6. Цель работы: разработка биокаталитических методов превращения целлюлозосодержащего растительного сырья (биомассы) в спирты (биотопливо); разработка эффективных методов предобработки биомассы мискантуса для последующего ферментативного гидролиза.

Сравнительный анализ существующих методов предварительной обработки ЦСС показал, что измельчение биомассы и обработка уксусной кислотой или гидроксидом кальция позволяют повысить продукцию сахаров за счет ферментативного гидролиза. Наработаны экспериментальные образцы предварительно обработанного ЦСС на основе биомассы мискантуса. В Escherichia coli клонированы последовательности генов ферментов комплекса карбогидраз бактерии рода Geobacillus, получены четыре новых рекомбинантных штамма микроорганизмов-продуцентов следующих ферментов: арабинофуранозидазы, глюкуронидазы, эндоксиланазы, бета-ксилозидазы. Наличие нужных карбогидраз в протеоме рекомбинантных штаммов подтверждено методом масс-спектрометрии. Штаммы депонированы во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов. Наработаны экспериментальные образцы ферментных препаратов на основе ферментов комплекса карбогидраз (4 шт.), содержащие коммерчески доступные и вновь клонированные ферменты. В результате обогащения коммерческих препаратов гемицеллюлазными активностями показано увеличения выхода сахаров более чем на 10 %.

На основе скрининга природных целлюлозолитических микроорганизмов выбраны 8 перспективных продуцентов биоэтанола, резистентных к токсическому воздействию ацетата. Микроорганизмы идентифицированы методом масс-спектрометрического биотипирования. Все выбранные микроорганизмы относятся к роду Bacillus. Наработаны экспериментальные образцы (3 шт.) штаммов микроорганизмов-продуцентов этанола, проведены их микроскопические исследования и разработана методика  культивирования, получены характеристичные масс-спектры белковых профилей. Штаммы депонированы.

В результате предобработки ЦСС и ферментативного гидролиза предобработанного ЦСС получено сырье, содержащее более 20 % сахаров. Разработана лабораторная методика получения сахаросодержащего сырья на основе биомассы мискантуса. Разработана лабораторная методика получения этанола из предобработанного ЦСС. Наработаны экспериментальные образцы целевого продукта биотоплива (2 шт.), содержащие более 75 % этанола. Проведены исследовательские испытания экспериментальных образцов.

Результаты НИР обеспечивают экологически безопасное ведение процесса, ресурсо- и энергосбережение (создание безотходного производства энергии), повышение комплексности и глубины переработки возобновляемого непищевого сырья.

Сведения

об участии Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук в реализации федеральных целевых, ведомственных и региональных программ в 2013 г.

1.Наименование программы

Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009–2013 гг.

2.Заказчик программы

Министерство образования и науки РФ

3. Наименование проектов:

3.1.Проект «Нейробиология депрессивных состояний: выявление молекулярных звеньев-мишеней для разработки антидепрессантов новых типов»

Соглашение 8060 от 01.01.2013 г.

3.2.Проект «Исследование трехмерной организации генома половых и соматических клеток методом Hi-C»

Соглашение 8095 от 01.01.2013 г.

3.3.Проект «Мониторинг распространения и генетического разнообразия паразитических микроспоридий рода Nosema в природных популяциях шмелей (род Bombus) и пчел (род Apis)»

Соглашение 8124 от 01.01.2013 г.

3.4.Проект «Разработка технологии масштабного получения специфических типов нейронов головного мозга с использованием эффекта эпигенетической памяти индуцированных плюрипотентных стволовых клеток»

Соглашение 8264 от 01.01.2013 г.

3.5. Проект «Исследование молекулярных механизмов социального поведения: поиск новых мишений для коррекции патологий»

Соглашение 8474 от 01.01.2013 г.

3.6. Проект «Интегрированная биоинформационная платформа анализа данных экспрессии генов в тканях мозга»

Соглашение 8740 от 01.01.2013 г.

4. Основные результаты законченных этапов работы

4.3.1.Анализ новых молекулярных внутриклеточных мишеней – белка сигнальной трансдукции интерлейкинов gp130 и антиапоптозного белка Bcl-xL – выявил участие этих белков в проявлении психопатологии наследственного и стрессорного генеза. Впервые обнаружено повышение экспрессии мРНК белка gp130 в гиппокампе при остром стрессе и, наоборот, снижение его экспрессии в результате действия хронического эмоционального стресса. Установлена повышенная экспрессия мРНК белок Bcl-xL в отделах головного мозга животных, генетически предрасположенных к проявлению депрессивноподобного состояния, что является первым свидетельством вовлечения этого белка в психопатологию наследственного генеза. Подробный анализ эффектов гипоксии и глюкокортикоидов в неонатальный период развития выявил их влияние и взаимодействие в определении уровней мРНК и белка Bcl-xL в отделах формирующегося головного мозга, а также влияние на проявление депрессивного поведения в раннем онтогенезе и в последующие периоды жизни. Однако рассогласование эффектов этих воздействий на экспрессию нейрогена и поведение не позволяет рассматривать белок  Bcl-xL в качестве мишени для коррекции негативных нейрологических последствий глюкокортикоидной терапии респираторного дистресс синдрома новорожденных. Не участвует в механизмах этого синдрома и белок gp130 в силу следового уровня его экспрессии в мозге новорожденных. Уровни экспрессии белков gp130 и Bcl-xL в головном мозге взрослых животных при формировании и проявлении депрессивных состояний взаимосвязаны с экспрессией рецепторов глюкокортикоидов, мозгового нейротрофического фактора (BDNF), а также маркера активности серотонинергической системы мозга тирозингидроксилазы-2. Комбинированное воздействие на адренергические и глюкокортикоидные рецепторы способно нивелировать негативные последствия активации каждого из них в отдельности для экспрессии нейрогенов. В результате анализа эффектов 8-(трифторметил)-1,2,3,4,5-бензопентатиепин-6-амина на экспрессию белка gp130 и BDNF в головном мозге, а также депрессивноподобное поведение разработан модельный способ воздействия на функцию нейрогенов в мозге, позволяющий рассматривать этот препарат в качестве перспективного нового антидепрессанта.

В ходе выполнения проекта впервые выявлено, что наследственно обусловленная предрасположенность к формированию депрессивноподобного состояния может ассоциироваться с повышением экспрессии антиапоптозного белка Bcl-xL во  фронтальной коре, гиппокампе и среднем мозге. Впервые обнаружен возрастной градиент экспрессии белка каскада сигнальной трансдукции интерлейкина 6 – gp130: в гиппокампе новорожденных уровень его мРНК  более чем в 250 ниже, чем у взрослых, что препятствует участию этого белка в психопатологии онтогенетического генеза. Впервые установлено повышение экспрессии gp130 в мозге в период формирования у взрослых животных индуцированного стрессом депрессивноподобного состояния. Также впервые выявлена обратная зависимость между экспрессий gp130 и повышением уровня глюкокортикоидов в крови при остром воздействии, а также при хронических стрессорных воздействиях, индуцирующих у чувствительных к стрессу особей  депрессию. В целом эти результаты впервые позволяют рассматривать внутриклеточные белки  Bcl-xL и gp130 в качестве терапевтических мишеней депрессивных расстройств наследственного и индуцированного стрессом генеза.  Результаты выполнения данного проекта будут использованы для решения последующих задач проекта по анализу функционального взаимодействия внутриклеточных белков gp130 и антиапоптозного белка Bcl-xL с гормональными и нейрохимическими факторами формирования и проявления депрессивноподобного состояния и разработки модельных способов воздействия на функцию этих белков традиционными и новыми средствами фармакологии.

4.3.2.Пространственная (3D) организация генома эукариот играет важную роль в функционировании ядерного материала. Однако до сих пор наши знания о глобальной архитектуре генома не позволяют построить адекватную 3D модель генома на всех уровнях разрешений. Данный проект стал первым в России масштабным исследованием с использованием последних достижений в области пространственной организации генома эукариот. Основной научной задачей проекта была проверка возможности использования 3С методов, и в частности метода Hi-C, для исследования генома сперматозоидов. На современном уровне развития науки задача построения модели пространственной организации генома половых клеток является крайне актуальной, поскольку представляет интерес как с фундаментальной, так и с прикладной точек зрения.

В ходе реализации проекта были проведены теоретические исследования по существующим на данный момент методам исследования 3D структуры генома. Был подготовлен обзор по перспективным 3С методам исследования. В рамках выполнения проекта впервые была получена Hi-C ДНК-библиотека сперматозоидов мыши. На заключительном этапе работ было проведено массовое параллельное секвенирование полученных ДНК-библиотек на платформе Illumina GAII по методике парного секвенированиия. Было показано, что в созданных ДНК-библиотеках имеется информация о пространственных взаимодействиях значительной части генома, иными словами,  полученные данные достаточно полно покрывают весь геном.

Таким образом, в результате выполнения проекта впервые был  применен метод Hi-C для получения ДНК-библиотеки взаимодействующих районов генома сперматозоида. Было показано, что применение методики приготовления ДНК-библиотеки взаимодействующих районов генома методом Hi-C позволяет получать качественные данные для исследования пространственной организации генома сперматозоидов.

Все поставленные в проекте задачи выполнены в полном объеме. Полученные результаты могут быть использованы для дальнейших исследований особенностей пространственной организации генома половых клеток, исследований роли пространственной организации генома половых клеток при патологиях, приводящих к бесплодию.

Полученные результаты могут быть использованы в образовательных целях, для чтения курса лекций по цитологии, генетике, молекулярной биологии, физиологии и биологии стволовых клеток.

4.3.3.В результате выполнения работ по проекту был установлен уровень зараженности шмелей природных популяций на территории Западной Сибири (Кузнецкий Алатау, Горная Шория, Белово и Гурьевск, Алтай) и Индии (Джамму и Кашмир) микроспоридием Nosema bombi. Установлено, что два широко распространенных вида шмелей, Bombus аgrorum и Bombus equestris, не подвержены заражению Nosema bombi и являются наиболее подходящими кандидатами для промышленного разведения  в качестве опылителей в теплицах. В результате сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей генов рРНК были выявлены 4 различных генетических варианта Nosema bombi, 2 из которых описаны впервые. С помощью молекулярно-филогенетического анализа было установлено, что все известные в настоящее время микроспоридии, поражающие шмелей, принадлежат двум видам: Nosema bombi и Nosema ceranae. В рамках проекта были сконструированы  уникальные пары праймеров, которые могут быть использованы для лабораторной ПЦР диагностики микроспоридий Nosema в коммерческих и природных популяциях медоносных пчел и шмелей.

4.3.4.Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) являются уникальным источником различных дифференцированных клеточных производных, в частности специфических типов нейронов головного мозга. На сегодняшний день актуальной задачей остается поиск новых способов эффективного, масштабного и направленного получения дифференцированных производных из ИПСК. Целью данной работы была разработка методик получения, культивирования и репрограммирования вазопрессинергических нейронов крыс WAG и Браттлборо. В ходе выполнения данного проекта были впервые получены культуры нейронов, выделенных из гипоталамусов крыс линий WAG и Браттлборо. Была разработана методика репрограммирования нейронов и эмбриональных фибробластов к плюрипотентному состоянию. Впервые установлен факт специфической гибели нейронов гипоталамуса при трансдукции лентивирусами, экспрессирующими гены, необходимые для репрограммирования к плюрипотентному состоянию, и предложены варианты решения этой проблемы. В ходе проекта были впервые получены культуры гипоталамических нейронов крыс линий Браттлборо и WAG. Кроме того, впервые была применена система лентивирусных векторов, обеспечивающая управляемую транскрипцию генов, необходимых для репрограммирования клеток, для получения ИПСК крыс из нейронов головного мозга. Впервые получены стабильные линии ИПСК крыс Браттлборо, которые являются моделью наследственного гипоталамического несахарного диабета. Полученные культуры гипоталамических нейронов и ИПСК крыс Браттлборо и WAG могут способствовать развитию представлений о природе эффекта эпигенетической памяти и позволят исследовать возможность применения данного феномена при масштабном получении специфических типов нейронов головного мозга. Впервые установлен факт избирательной гибели гипоталамических нейронов при воздействии лентивирусами (трансдукции) и нуклеофекции плазмидными конструкциями.

4.3.5.Объектом исследования служила уникальная популяция серебристо-черных лисиц, прошедшая длительный (около 50 лет) отбор на «доброе» и агрессивное поведение по отношению к человеку. Целью проекта являлась идентификация молекулярных механизмов формирования поведенческого ответа на социальные сигналы. В процессе работы проводилось создание и секвенирование кДНК библиотек из образцов мозга и анализ дифференциальной экспрессии генов «добрых» и агрессивных лисиц. Впервые создана репрезентативная выборка образцов РНК высокого качества из переднего мозга лисиц, селекционированных по поведению. Впервые выполнено секвенирование кДНК библиотек из образцов мозга лисиц, селекционированных по поведению, на секвенаторе нового поколения Illumina HiSeq 1000. Впервые проведена идентификация дифференциально экспрессирующихся генов в префронтальной коре и миндалине «добрых» и агрессивных лисиц.

Наибольшие различия выявлены в генных цепях, включающих межклеточную сигнализацию и взаимодействия, развитие и функционирование нервной системы, а также экспрессию генов. Среди канонических путей наибольшие различия в экспрессии генов в мозге между «добрыми» и агрессивными лисицами были обнаружены в сигнальной системе дофаминовых рецепторов. Значительные различия были выявлены в экспрессии генов глютаматной и серотониновой систем, а также генов вовлеченных в развитие мозга.

Полученные результаты использованы для разработки учебно-методических материалов и в проведении лекций и семинаров по молекулярной биологии, генетике количественных признаков, генетике поведения при подготовке кадров высшей квалификации в ИЦиГ СО РАН, Новосибирском государственном университете и Санкт-Петербургском государственном университете.

4.3.6.Пространственная (3D) организация генома эукариот играет важную роль в функционировании ядерного материала. Однако до сих пор наши знания о глобальной архитектуре генома не позволяют построить адекватную 3D модель генома на всех уровнях разрешений. Данный проект стал первым в России масштабным исследованием с использованием последних достижений в области пространственной организации генома эукариот. Основной научной задачей проекта была проверка возможности использования 3С методов, и в частности метода Hi-C, для исследования генома сперматозоидов. На современном уровне развития науки задача построения модели пространственной организации генома половых клеток является крайне актуальной, поскольку представляет интерес как с фундаментальной, так и с прикладной точек зрения.

В ходе реализации проекта были проведены теоретические исследования по существующим на данный момент методам исследования 3D структуры генома. Был подготовлен обзор по перспективным 3С методам исследования. В рамках выполнения проекта впервые была получена Hi-C ДНК библиотека сперматозоидов мыши. На заключительном этапе работ было проведено массовое параллельное секвенирование полученных ДНК-библиотек на платформе Illumina GAII по методике парного секвенирования. Было показано, что в созданных ДНК-библиотеках имеется информация о пространственных взаимодействиях значительной части генома, иными словами,  полученные данные достаточно полно покрывают весь геном.

Таким образом, в результате выполнения проекта впервые был  применен метод Hi-C для получения ДНК-библиотеки взаимодействующих районов генома сперматозоида. Было показано, что применение методики приготовления ДНК-библиотеки взаимодействующих районов генома методом Hi-C позволяет получать качественные данные для исследования пространственной организации генома сперматозоидов.

Все поставленные в проекте задачи выполнены в полном объеме. Полученные результаты могут быть использованы для дальнейших исследований особенностей пространственной организации генома половых клеток, в медицинских исследованиях роли пространственной организации генома половых клеток при патологиях, приводящих к бесплодию.

Полученные результаты могут быть использованы в образовательных целях, для чтения курса лекций по цитологии, генетике, молекулярной биологии, физиологии и биологии стволовых клеток.

Гранты Президента РФ для государственной поддержки молодых ученых-кандидатов наук и докторов наук и средства для государственной поддержки ведущих научных школ РФ

1. Заказчик программы

Министерство образования и науки РФ

2. Наименование проектов:

2.1. Проект «Регуляторные гены биосинтеза флавоноидов злаков и их роль в увеличении продолжительности жизни семян и устойчивости растений к неблагоприятным факторам окружающей среды»

14.122.13.2615-МД от 04.02.2013 г.

2.2. Проект «Изучение структурной организации хромосомы 5В мягкой пшеницы с использованием современных технологий по картированию и секвенированию аллополиплоидных геномов»

16.120.11.2573-МК от 01.01.2013 г.

2.3. Проект «Изучение методами биоинформатики и системной биологии закономерностей структурно-функциональной организации и эволюции молекулярно-генетических систем»

16.120.11.5278-НШ  от 01.01.2013 г.

3. Основные результаты законченных этапов работы

3.3.1. Изучение организации и эволюции регуляторных генов является актуальной проблемой молекулярной генетики. Целью настоящего проекта являются выделение и анализ регуляторных генов биосинтеза флавоноидных пигментов пшеницы и ячменя и установление взаимосвязи между их экспрессией и устойчивостью растений к стрессовым воздействиям, а также всхожестью семян после длительного хранения. На данном этапе работы впервые выделены полноразмерные нуклеотидные последовательности ключевых регуляторных генов биосинтеза флавоноидных пигментов пшеницы и ячменя и определена их локализация. Созданы моноинсерционные линии пшеницы и охарактеризованы имеющиеся изогенные линии ячменя, необходимые для дальнейшего исследования функциональных особенностей и роли выделенных генов.

3.3.2. Проект посвящен физическому картированию короткого плеча хромосомы 5В мягкой пшеницы Triticum aestivum. Физическое картирование включает в себя следующие этапы: 1) получение насыщенной молекулярными маркерами генетической карты хромосомы; 2) рестрикционное картирование (фингерпринтинг) хромосом-специфичной ВАС-библиотеки и отбор минимально перекрывающегося набора ВАС-клонов; и 3) сопоставление генетической карты с набором минимально перекрывающихся клонов.

Генетическое картирование проводилось с использованием картирующей популяции F2 объемом 366 растений от скрещивания мягкой пшеницы сорта Chinese Spring (CS) и Chinese Spring с замещенной хромосомой 5B, полученной от тетраплоидной пшеницы Triticum dicoccoides. В генетическую карту хромосомы 5BS включены 56 маркеров. Библиотека, специфичная для хромосомы 5BS (длина хромосомы 290 млн п.н.), получена в Институте экспериментальной ботаники (Оломоуц, Чехия), и передана в распоряжение ИЦиГ СО РАН.  В результате проведенного  фингерпринтинга сформирован минимальный набор из 3164 перекрывающихся ВАС-клонов, покрывающий 99 % длины хромосомы. Сопоставление генетической карты с набором минимально перекрывающихся клонов осуществлялось с помощью ПЦР-скрининга. На хромосоме 5BS локализованы 23 контига (групп перекрывающихся ВАС-клонов) суммарной длиной 12,5 млн п.н, содержащие 20 генетически картированных ISBP-маркеров, 1 SSR маркер, а также 6 маркеров к генам Tsn1  (ген чувствительности к патогену Stragonospora nodorum)  и Skr1 (ген, отвечающий за скрещиваемость). Таким образом, завершены этапы работы, необходимые для успешного физического картирования.

3.3. Микро-РНК (миРНК) – являются короткими фрагментами РНК, которые формируются в результате процессинга генов пре-миРНК. В составе RISC комплекса они способны взаимодействовать с мРНК генов, кодирующих белки, и приводить к деградации мРНК или нарушению процесса трансляции. миРНК являются регуляторами экспрессии, вовлеченными, как правило, в процессы развития организмов.

С помощью разработанного конвейера программ компьютерного анализа для выявления микроРНК (миРНК) в транскриптомах, полученных методом высокопроизводительного секвенирования, был проанализирован транскриптом червя Opistorchis felineus, паразитирующего в печени человека и вызывающего целый ряд опасных заболеваний, в числе которых – холангиокарциномы (рак желчного пузыря). Анализ высокопроизводительного секвенирования транскриптомов, представленных в 5 библиотеках из нескольких тканей/стадий развития O. felineus (марита без яиц, марита с яйцами, метацеркарий), позволил впервые идентифицировать мрРНК этого организма, в частности, связанные с процессами развития организма (let-7), регуляции апоптоза (mir-2a, mir-2b), дифференцировки клеток (mir-71, mir-71b) и ряд других (всего 18 ми-РНК, имеющих гомологов в БД miRBase). Анализ транскриптомов родственных организмов позволил выявить наличие этих микро-РНК и в геномах паразитических трематод Opistorchis viverrini и Clonorchis sinensis и оценить эволюционную изменчивость их последовательностей. Полученные результаты являются важными для дальнейшего изучения жизненного цикла O. felineus и механизмов его патологического влияния на организм человека.

Грант Правительства Российской Федерации для государственной поддержки научных исследований, проводимых под руководством ведущих ученых в российских образовательных учреждениях высшего профессионального образования, научных учреждений государственных академий наук и государственных научных центрах
Российской Федерации

Проект «Идентификация генов, ответственных за функции мозга и патологии, на основе экспериментального исследования и биоинформатической реконструкции генных сетей нейробиологических процессов»

г/к 14.В25.31.0033 от 28.06.2013г.

Цель проекта: идентификация генов, ответственных за функции мозга и патологии, на основе экспериментального исследования и биоинформатической реконструкции генных сетей нейробиологических процессов, контролирующих терморегуляцию, пищевое поведение и их взаимодействие, а также формирование предрасположенности к болезни Альцгеймера, депрессивным состояниям, агрессии, дружелюбному поведению.

Основные результаты, полученные при выполнении работ первого этапа проекта.

Созданы коллекции биологического материала, которые будут использованы в дальнейшей работе по проекту: пациентов с болезнью Альцгеймера и здоровых индивидов без признаков деменций; индивидов с контрастными метаболическими и пищевыми фенотипами (ожирением, избыточной массой тела, гиперхолистеринемией, пониженным уровнем общего холестерина, а также с нормальной массой тела, нормальным уровнем общего холестерина, бронхиальной астмой с/без холодовой гиперреактивностью дыхательных путей); экспериментальных животных моделей агрессивного и дружелюбного поведения (лисиц); экспериментальных животных моделей депрессивноподобного состояния (мышей); палеоантропологические образцы представителей древнего населения Сибири.

Выделены образцы геномной ДНК из образцов сформированных коллекций. Приготовлены фрагментные библиотеки образцов геномной ДНК для секвенирования с использованием платформ для масштабного параллельного секвенирования для двух пациентов с болезнью Альцгеймера, пациента с Х-сцепленной мозжечковой гипоплазией, мышей линий ASC и CBA, лисицы из неселектированной группы (дикий тип), двух представителей населения Сибири эпохи голоцена.

Секвенированы полные геномы: пациента с неврологическим заболеванием (X-сцепленной непрогрессирующей врожденной мозжечковой гипоплазии); двух пациентов с болезнью Альцгеймера; двух мышей каталептических линий ASC и CBA; лисицы из неселектированной группы (дикий тип).

Впервые в результате экспериментальных исследований выявлены и подтверждены мутации в генах ABCB7 и ATP7A у больных с X-сцепленной мозжечковой гипоплазией.

Проведен анализ генетических ассоциаций 5 полиморфных маркеров в гене TRPM8 с показателями липидов плазмы крови и антропометрическими параметрами у русских. Более высокий уровень общего ХС, ХС ЛПНП и ХС ЛПВП обнаружен у индивидов с гетерозиготным генотипом rs11563071, а средние значения ТГ были выше у индивидов с гомозиготным генотипом по минорному аллелю  rs11563208.  Полиморфизмы rs11562975, rs7593557 коррелируют с антропометрическими параметрами. Средние значения этих показателей выше у индивидов с гетерозиготным генотипом по rs11562975 и гомозиготным генотипом по минорному аллелю rs7593557.

В ходе биоинформатических исследований

– сформирован список ключевых генов молекулярно-генетических систем, связанных с пищевым питанием, включая гены, контролирующие чувство голода и липидный метаболизм;

– реконструированы ассоциативные генные сети, контролирующие пищевое питание и метаболизм;

– установлена связь полиморфных вариантов в гене GALR1 с изменениями аффинности TATA-бокса;

– разработано программное обеспечение ngs-pipeline для анализа данных глубокого секвенирования;

– разработана компьютерная система по оценке чувствительности и надежности глубокого секвенирования и определению уровня ошибок при выявлении мутантных или полиморфных генов; выборке и интерпретации функционально значимых полиморфизмов, имеющих медико-биологическое значение;

– c использованием ngs-pipeline идентифицированы два наиболее вероятных гена, нарушения в которых ведут к развитию Х-сцепленной врожденной мозжечковой гипоплазии: ген ABCBA7 и ген ATP7A;

– с использованием ngs-pipeline  выявлены гены и регуляторные участки генома, которые потенциально могут влиять на патогенез болезни Альцгеймера;

– на основе анализа данных глубокого секвенирования мышей линий ASC и CBA были уточнены границы локуса, ответственного за щипковую каталепсию у мышей, а также выявлены генетические особенности геномов, которые потенциально могут отвечать за развитие у мышей линий ASC и CBA щипковой каталепсии;

– впервые произведена сборка de novo генома лисицы, получены последовательности контигов и скаффолдов, которые являются первыми референсными геномными последовательностями для данного вида.

Таким образом, были успешно выполнены все задачи, поставленные для решения на первом этапе выполнения работ по проекту. Работа выполнена на уровне мировых стандартов, все полученные результаты являются абсолютно новыми.